Gen-Panel-Diagnostik: Ein Meilenstein in der Forschung - und in der Medizin

M. Sc. Kerstin Alt
Zeitersparnis, Kostensenkung und eine große Hilfe auch für Patienten und ihre Angehörigen – die Hochdurchsatz-Sequenzierung ist ein Meilenstein in der humangenetischen Diagnostik. Ihre Entwicklung hat vor gut einem Jahrzehnt begonnen und ist noch längst nicht am Ende angekommen. Ein Überblick:
Keine Krankheit ist zu selten, um ihr nicht volle Aufmerksamkeit zu schenken – so die Devise des im Jahr 1997 gegründeten Orphanets, eine europäische Initiative, die es zum Ziel hat, über seltene Erkrankungen aufzuklären und die Diagnosestellung sowie Versorgungs- und Behandlungsstruktur in Europa zu verbessern.(1) „Selten" bedeutet hier, dass unter 2000 Menschen nicht mehr als ein einziges Individuum von einer bestimmten Erkrankung betroffen ist. (2)

Je seltener aber eine Erkrankung ist, desto weniger Wissen über Ursache, Symptome sowie Therapiemöglichkeiten ist verfügbar.

In den meisten Fällen genetisch bedingter seltener Erkrankungen ist eine konkrete Differentialdiagnose daher sehr schwierig. Beispielsweise kann laut neuesten Ergebnissen aus der Epilepsie-Forschung das mutierte Gen, das als Krankheitsursache infrage kommt, mit ausreichender klinischer Sicherheit nur in 15 % der gelösten Fälle vor einer genetischen Untersuchung spezifiziert werden. (3)



Tausende Gene parallel sequenziert

Die vorherige Festlegung des Gens, in dem sich die krankheitsverursachende Mutation befinden könnte und das daher untersucht werden soll, war bis dato aber sehr entscheidend. Denn mit der bisher als Goldstandard in der Routinediagnostik von Erbkrankheiten eingesetzten Sanger-Sequenzierung (4) kann aufgrund des technisch beschränkten Tagesdurchsatzes von ca. 300 Kilobasen (kb) pro Sequenzierroboter nur ein Gen nach dem anderen analysiert werden. Bei einzelnen Erkrankungsbildern kann dies ausreichend sein, da Mutationen in nur einem Gen krankheitsrelevant sind, wie es zum Beispiel im Falle der Skeletterkrankung „Achondroplasie" zutrifft. Die meisten seltenen Erkrankungssyndrome werden jedoch durch Mutationen in verschiedenen Genen verursacht. Das machte die Entwicklung einer neuen und besseren Technologie notwendig, die eine parallele Sequenzierung hunderter bis tausender Gene ermöglicht. Innerhalb des letzten Jahrzehnts wurden mehrere sogenannte Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation (engl. next generation sequencing = NGS) entwickelt. Aufgrund der massiven Parallelsequenzierung und der dadurch produzierten riesigen Datenmengen von bis zu 120 Gigabasen (Gb; dies entspricht 120 Millionen kb) pro Sequenzierlauf werden diese neuen Techniken auch unter dem Begriff Hochdurchsatz-Sequenzierung zusammengefasst. Da mit den neuen Geräten nicht nur viele Gene, sondern auch mehrere Krankheitsfälle gleichzeitig analysiert werden können, führt dies zu einer immensen Zeiteinsparung und Kostensenkung. Noch viel größer ist der Nutzen jedoch für den Patienten selbst. Bei der Sanger-Sequenzierung muss man sich auf die Analyse weniger Gene festlegen, die dann nacheinander sequenziert werden. Eine Untersuchung weiterer Gene wäre zwar prinzipiell möglich, wird aber aufgrund des niedrigen Kosten-Nutzen-Verhältnisses selten durchgeführt. Mit den neuen Gen-Panels hat der betreuende Facharzt nun die Möglichkeit, die Gen-Auswahl von Anfang an enorm zu erweitern und somit die Chancen für die Identifizierung der genetischen Ursache deutlich zu steigern. Für den Patienten und dessen Familie stellt das Finden der Krankheitsursache oft eine große Erleichterung dar. Mit der vor ein paar Jahren eingeführten Panel-Diagnostik konnte sogar schon so mancher „alte Fall" gelöst werden, bei dem zuvor bereits mehrere Gene per Sanger ohne diagnostischen Erfolg sequenziert wurden. Dem Patienten wird so eine weitere Odyssee mit unzähligen Arztbesuchen, invasiven Untersuchungsmethoden und falschen Therapieansätzen erspart. Im Optimalfall bedeutet eine schnelle Diagnose eben auch einen früheren Therapiebeginn bzw. eine frühere Umstellung auf eine gezielte Therapie. Im Bereich der frühkindlichen Epilepsien ist es zum Beispiel nicht nur entscheidend, in welchem Gen sich die krankheitsverursachende Mutation befindet, sondern auch, ob sie zu einem Funktionsverlust oder -zugewinn führt. So sprechen Patienten mit pathogenen KCNQ2-Varianten, die zu einem Funktionsverlust des Kaliumkanals führen, gut auf antiepileptische Medikamente wie Ezogabin an, die am Kaliumkanal wirksam sind, während Patienten mit gesteigerter Kaliumkanalaktivität refraktär zu sein scheinen. (5)

Ungenutzes Potenzial

Vor einem knappen Jahrzehnt fanden die neuen NGS-Techniken erstmals klinische Anwendung in der Diagnosestellung von seltenen Erkrankungen. Am genetikum stehen seit 2012 Gen-Panels für die Diagnostik zur Verfügung. Seither steigen sowohl Anzahl als auch Umfang der angebotenen Gen-Panels stetig. Zudem werden sie laufend bezüglich Genabdeckung und -Auswahl optimiert. Im Jahr 2016 wurden mehrere Änderungen im Einheitlichen Bewertungsmaßstab (EBM) eingeführt. Der neue EBM beinhaltet nun eine Sequenzierleistungsziffer, die unabhängig von der verwendeten Sequenziermethode ist. Somit können seit dem 1. Juli 2016 auch NGS-Laborleistungen abgerechnet werden, allerdings nur Gen-Panels bis 25 kb – für eine Analyse von über 25 kb muss ein entsprechender Antrag an die gesetzlichen Krankenkassen (GKV) gestellt und von diesen bewilligt werden. Die Mehrheit dieser Anträge wird derzeit jedoch aus unklaren Gründen abgelehnt, weshalb momentan im Durchschnitt lediglich 5 bis 10 Gene pro Patient bewertet werden können. Dies stellt zwar bereits einen Fortschritt gegenüber der Sanger-Sequenzierung dar, jedoch bleibt dadurch die genetische Ursache insbesondere von sehr seltenen Erkrankungen oftmals ungeklärt – obwohl die Technik dafür bereits vorhanden ist. Dennoch werden die neuen Sequenziertechniken – aufgrund der damit verbundenen Kosten- und Zeitersparnis sowie der höheren Erfolgsrate – weiterhin mehr und mehr Einzug in die humangenetische Routinediagnostik halten, insbesondere im Bereich der heterogenen Erkrankungsgruppen, wie Muskelerkrankungen, Neuropathien, Epilepsien und geistigen Behinderungen.


NGS - Was passiert dabei?

Bis vor kurzem war die Kettenabbruchmethode nach dem britischen Biochemiker Frederick Sanger das Mittel der Wahl zur Analyse von DNA-Sequenzen. Sie erlaubt es, DNA-Einzelfragmente mit einer Länge von bis zu 800 Basenpaaren durch Kettenabbrüche und elektrophoretische Auftrennung der unterschiedlich langen Syntheseprodukte zu sequenzieren. Ein für diese Reaktion eingesetzter Sequenzierroboter generiert durchschnittlich 300 Kilobasen pro Tag. In den großen Labors standen 20 und mehr dieser Sequenzierroboter nebeneinander, um einen höheren Durchsatz zu erreichen. Bei den neuen NGS-Techniken kann auf allein einem Gerät ein Durchsatz von bis zu 120 Gigabasen pro Sequenzierlauf erlangt werden. Im letzten Jahrzehnt wurden viele verschiedene NGS-Techniken entwickelt, die sich in a) Vervielfältigungs- und Sequenziertechnik, b) Basendetektion, c) Qualität, d) Durchsatz, e) beanspruchter Zeit und f) Anschaffungs- sowie Materialkosten erheblich unterscheiden. Je nach Anwendungsgebiet bietet die eine oder die andere Technik den größeren Vorteil (für Details siehe Metzker, 2010) (6). Die am häufigsten in der humangenetischen Diagnostik verwendete Methodik ist die „Brückenamplifikation" und die „Sequenzierung durch Synthese". Um die parallele Sequenzierung mehrerer Gene von unterschiedlichen Patienten zu ermöglichen, werden hierbei die jeweiligen DNA-Sequenzen zunächst spezifisch markiert. Die Vervielfältigung swe Patienten-DNA selbst geschieht durch die Brückenamplifikationkation", welche zunächst die Fixierung der jeweiligen DNA-Einzelfragmente an einer Oberfläche, beispielsweise an kleinen Kügelchen oder an einer Glasoberfläche, beinhaltet.Während der massiven Vervielfältigung der DNA-Fragmente, die durch Zugabe entsprechender Reagenzien und Enzyme umgesetzt wird, werden diese weiterhin an der besagten Oberfläche festgehalten. Nachdem die Einzelfragmente lokal angereichert voeliegen, wird die Seuqenzierreaktion, also das Ablesen jeder einzelnen Base des Strangs, an derselben Oberfläche geführt. Somit finden Vervielfältigung und Sequenzierreaktion in ein und demselben Gerät statt. Bei der Sequenzierung durch Synthese kann dann quasi „live" am sich bildenden DNA-Strang das für jeden Baustein spezifische Lichtsignal mithilfe einer speziellen Kamera detektiert werden. Anschließend müssen die im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung eher kurzen Einzelfragmenete durch die Patienten-spezifische Markierung wieder jedem einzelnen Patienten zugeordnet werden. Danach erfolgt die Anordnung der Einzelfragmente unter Zuhilfenahme des seit 2001 bekannten menschlichen Refrenezgenoms, mit dem mögliche Veränderungen abgeglichen werden.

Was sind Gen-Panels?

In einem Gen-Panel werden unter Anwendung der NGS-Methode mehrere Gene, die mit einem bestimmten Krankheitsbild assoziiert sind, gleichzeitig sequenziert. Dabei ergeben sich teilweise riesige Datenmengen, die unter Zuhilfenahme der Bioinformatik prozessiert werden. Eine zuvor getroffene Genauswahl wird anschließend von den Humangenetikern analysiert. Zielführend ist die Anwendung von Gen-Panels besonders bei heterogenen Erkrankungsgruppen wie Muskelerkrankungen, neurologischen Erkrankungsbildern, unklaren Fehlbildungs- und Retardierungssyndromen und Epilepsien. Die Anzahl der sequenzierten Gene ist abhängig von der Erkrankungsgruppe und variiert stark von wenigen einzelnen Genen bis hin zu über tausend sequenzierten Genen. Entscheidend für eine Eingrenzung der beim Patienten vorliegenden seltenen Erkrankung und die damit verbundene Genauswahl ist eine enge Zusammenarbeit mit den behandelnden Fachärzten.

Quellen:

(1) http://www.orpha.net

(2) http://www.namse.de/seltene-erkrankungen

(3) Trump N, McTague A, Brittain H, et al.: Improving diagnosis and broadening the phenotypes in early-onset seizure and severe developmental delay disorders through gene panel analysis. J Med Genet 53: 310-317 (2016)

(4) Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467 (1977)

(5) Olson HE, Kelly M, LaCoursiere CM, et al.: Genetics and Genotype-Phenotype Correlations in Early Onset Epileptic Encephalopathy with Burst Suppresion. Ann Neurol 81: 419-429 (2017)

(6) Metzker ML: Sequencing technologies - the next generation. Nat Rev Genet 11: 31-46 (2010)

Gen-Panel-Diagnostik: Entwicklungsstörungen klären
PD Dr. Dr. Birgit Zirn und Dr. Eva Rossier

Next Generation Sequencing
Dipl. Ing. Marius Kuhn, Prof. Dr. med. Horst Hameister