genetics of our "best friend"

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Prof. Dr. med. Horst Hameister

Sehr überraschend hat sich der Hund als ein hervorragendes Modell für die Identifizierung von einfach mendelnden Erkrankungen, aber auch für das viel anspruchsvollere Ziel des Verstehens von komplexen genetischen Erkrankungen herausgestellt. Mit diesem Artikel soll gezeigt werden, welche Besonderheiten diese Entwicklung ermöglicht haben.

Die heute bekannten Hunderassen zeichnen sich durch eine ganz außerordentliche Vielfalt aus. Diese betrifft nicht nur die Größe (Abb. 1), sondern auch viele weitere morphologische Kriterien, wie zum Beispiel Kopfform, Länge der Extremitäten, Fellfarbe, aber auch solche für den Humangenetiker noch schwer zu verstehende Merkmale, wie Charakter und Verhalten.



Abb 1: Größenunterschiede beim Hund (Bild: Mike Flair)



Bekannt ist auch eine sehr unterschiedliche Krankheits- und Tumordisposition der verschiedenen Hunderassen (Tabelle 1). Die Erkrankungen beim Hund sind dank der weitverbreiteten und gut entwickelten Tiermedizin sehr gut beschrieben und analysiert. Es ist kein Geheimnis, dass in Ländern wie unserer Bundesrepublik aber auch in den USA viel mehr Aufwand für die Gesundheit der Hunde betrieben wird, als in vielen anderen Ländern der Welt für die Gesundheit der Menschen.



Tabelle 1: Erkrankungen beim Hund und beim Menschen


Überraschende Ähnlichkeiten

Nur schwer nachvollziehbar war es deshalb zunächst, als im Jahr 2001 die Initiative des American Kennel Club, dem Amerikanischen Hundezüchterverein, bekannt wurde, das Genom des Hundes zu sequenzieren. Im Jahr 2003 wurde eine erste, rohe Genomsequenz eines Pudels vorgestellt. Schon diese Genomanalyse erwies sich als ausgesprochen informativ. In der Folge konnten die biomedizinischen Grundlagenforscher das NIH (National Institutes of Health) überzeugen und es wurde 2005 eine sehr gut dokumentierte Genomsequenz einer Boxerhündin vorgelegt. Die Evolution zum Hund zeigt überraschende Ähnlichkeiten mit der Evolution des Menschen (Abb. 2). Die Besiedelung der Erde durch den modernen Menschen erfolgte von Ostafrika ausgehend durch eine begrenzte Anzahl von Individuen. Wir sprechen deshalb von einem „bottleneck“, also einem Flaschenhals. Solche Flaschenhälse betreffen die Entstehung des Homo sapiens vor 200.000 Jahren, den Übertritt nach Eurasien vor etwa 100.000 Jahren und die Besiedelung Asiens vor etwa 80.000 und Europas vor etwa 40.000 Jahren. Ganz ähnlich lief die Evolution der Hunde ab. Vor etwa 15.000 Jahren sind einzelne Wölfe in der Gegend der heutigen Mongolei erstmals gezähmt worden und zu diesem ursprünglichen Stamm von Hunden sind sehr wahrscheinlich nur wenige weitere ursprüngliche Wolfsindividuen hinzugekommen. Auch hier gibt es ein Bottleneck mit einer begrenzten Anzahl von Individuen und seit dieser Zeit auch nur eine begrenzte Anzahl von ca. 15.000 Generationen.



Abbildung 2: Die Evolution zu den ca. 400 Hunderassen und dem modernen Menschen im Vergleich. Eine Abspaltung (blauer Pfeil) beinhaltet einen Flaschenhals ("bottleneck"). Y=Jahre, MYA= Million years ago

Genetik in der Züchtung

Soweit zur Ähnlichkeit der Evolution von Hunden und Menschen. Schließlich kommt bei den Hunden aber noch einmal ein entscheidender Eingriff des Menschen hinzu, nämlich das Heranzüchten der etwa 400 heute registrierten verschiedenen Hunderassen. Diese Hunderassen sind nur 50 bis 200 Jahre alt und lassen sich ebenfalls auf nur ganz wenige und manchmal nur einzelne Individuen zurückführen, die ein auffallendes Merkmalsspektrum präsentierten. Diese Hunderassen sind gut dokumentiert und es sind zum großen Teil sehr reine Rassen (geschlossene Populationen).
Damit wird klar, dass jede Hunderasse vor sehr kurzer Zeit in sich auch wieder durch solch einen Bottleneck gegangen ist. Auf diese Besonderheit wird später noch eingegangen.

Von Hunden und Menschen

Wie schon aus dem Vergleich von Mensch und Maus bekannt, ist auch das Genom des Hundes dem des Menschen sehr ähnlich. Wir gehen von einer in etwa gleichen Anzahl von etwas über 20.000 Genen aus. Allein die Körpergröße des Hundes und damit eine dem Menschen sehr viel ähnlichere Physiologie sorgen dafür, dass die entsprechenden Mutationen und Erkrankungen vom Hund denen des Menschen sehr viel ähnlicher sind, als wir es von der Maus kennen. Vom Hund kennt man über 500 teilweise sehr gut beschriebene Erkrankungen. Diese Erkrankungen treten bevorzugt in bestimmten Rassen auf (Tabelle 1) und damit kommt unweigerlich die Genetik ins Spiel. Noch vor wenigen Jahren war man davon überzeugt, dass jetzt das Zeitalter der reversen, umgekehrten Genetik angebrochen sei. Seit Gregor Mendel die verschieden gestalteten Erbsen für seine genetischen Studien genutzt hatte, ging man in der Genetik vom Phänotyp aus und erforschte den zugehörigen Genotyp. Nachdem jetzt die Genomanalysen vorlagen, glaubte man vom Genotyp aus den Phänotyp erklären zu können (reverse Genetik). Man hat beispielsweise Mäuse hergestellt, bei denen man gezielt einzelne Gene ausgeschaltet hat (Knock-out Mutanten), um dann den Phänotyp der Mutanten zu untersuchen. Dieses Verfahren hat sich aber nur für wenige Gene bewährt.

Polymorphismen

In der vom Phänotyp ausgehenden Genetik (forward genetics) wird weiterhin eine präzise Beschreibung eines Phänotyps oder einer Erkrankung in einer Familie benötigt. Da informative Familien mit einer großen Anzahl von Kindern und der Zugänglichkeit von drei oder manchmal sogar vier Generationen für den Humangenetiker kaum mehr verfügbar sind, bedient man sich jetzt einer anderen Methode. Diese ist bekannt geworden als genomweite-Assoziationsstudie (GWA). Man sammelt tausende oder zehntausenede Patienten mit dem gleichen Merkmal bzw. der gleichen Erkrankung und untersucht an ihnen welche polymorphen genomischen Marker mit dem untersuchten Merkmal assoziiert sind.Als polymorphe Marker im Genom benutzt man sogenannte „single nucleotide polymorphisms“ (SNP), das sind einzelne Nukleotide in der Sequenz des Genoms, an denen bei der Untersuchung unterschiedlicher Individuen einer Population Basendifferenzen vorliegen. Wenn diese Sequenzunterschiede mit einer Häufigkeit von >1% vorkommen, nennt man sie Polymorphismen. Wir rechnen, dass jeder Mensch an jeder tausendsten Stelle im Genom eine Basendifferenz aufweist. Diese SNPs sind bekannt und man kann DNA-Chips kaufen, auf denen 300.000 bis zu 1 Million SNPs angeordnet sind. Durch Hybridisierung eines DNA-Chips einer Patienten-DNA kann bei diesen Patienten das SNP-Muster bestimmt werden. Nun muss man eine genügend große Patientenzahl für eine definierte Erkrankung oder Merkmal zusammenbekommen. Dafür bildet man ein Konsortium mit Hunderten von Wissenschaft-lern weltweit. Dann wird robotermäßig diese Analyse durchgeführt und anschließend werden die SNP- und Merkmalsdaten in die entsprechenden Rechenprogramme eingegeben und man erhält Assoziationswerte zwischen Merkmal und SNP. Das heißt, man erhält Hinweise, welche SNPs mit dem Merkmal am besten assoziiert sind. Diese GWA-Studien sind z.Zt. sehr beliebt. Der wissen-schaftliche Ertrag ist eher mäßig. Hier soll stellvertretend berichtet werden, welchen Beitrag die GWA-Studien an über 183.000 Probanden zur Körpergröße geleistet haben. Körpergröße ist zu 80% ein genetisches Merkmal, jedoch mit enormer Variation. Die durch diese GWA-Studien identifizierten 180 Loci erklären zusammen etwa 20% der genetischen Variation.

genomweite Assoziationsstudien

Diese genomweiten Assoziationsstudien sind sehr viel informativer beim Hund. Während man beim Menschen etwa 1 Million über das Genom verteilte SNPs braucht, sind für die Analyse eines bestimmten Merkmals einer Hunderasse nur ca. 15.000 bis 30.000 SNPs notwendig, um das gesamte Genom abzudecken. Der Grund dafür ist die sehr viel aus-geprägtere Einheitlichkeit des Genoms innerhalb einer Hunderasse. Diese Rasse wurde mit wenigen Hunden, prinzipiell nur mit einem Hundepaar, vor weniger als 200 Jahren etabliert. Seitdem sind erst etwa 50 bis 200 Generationen vergangen. Entsprechend ist dieses Genom nur durch wenige Rekombinations- bzw. Cross-over-Ereignisse neu kombiniert. Große Anteile bzw. Bruchstücke des Genoms sind überhaupt noch nicht neu kombiniert, das heißt, es besteht für diese Bruchstücke die identische SNP-Anordnung bei allen Hunden aus dieser Hunderasse (Abb. 3). Der Fachausdruck für die identische SNP-Anordnung innerhalb dieser Bruchstücke heißt Kopplungsungleichgewicht oder im Englischen „Linkage Disequilibrium“. Die Anordnung der SNPs auf einem einzelnen Bruchstück ist bei den Hunden aus einer Rasse immer identisch, weil sie noch nicht durch ein Cross-over von einander getrennt wurden. Diese Bruchstücke sind beim Hund ca. 1 Million Basenpaare lang. Beim Menschen sind seit der Entstehung des mo-dernen Menschen vor 200.000 Jahren etwa 10.000 Generationen vergangen. Entsprechend sind diese Bruchstücke sehr viel kleiner, sie sind etwa 25.000 Basenpaare lang. Daher braucht man für die Untersuchung beim Menschen eine sehr viel größere Anzahl an SNPs und viel aufwendigere Rechen-methoden. Es hat sich gezeigt, dass man diesen Nachteil beim Menschen ganz offensichtlich durch einen größeren Rechenaufwand nicht ausgleichen kann. Ganz anders sieht die Situation beim Hund aus. Für einfach mendelnde Merkmale braucht man nur 10 bis 20 Hunde und einen Chip mit etwa 15.000 bis 30.000 SNPs, um das Merkmal völlig zweifelsfrei im Genom zu kartieren.Mit diesem ersten Schritt ist das Merkmal relativ grob im Genom des Hundes zugeordnet. Für eine exakte Feinkartierung untersucht man in einem zweiten Schritt Tiere von anderen Hunderassen, die zufällig auch dieses Merkmal zeigen. Das klingt zunächst überraschend, weil man glaubt, diese Mutation kommt nur bei der spezifischen Hunderasse vor. Aber dazu muss man wissen, dass nicht Neumutationen zu den heutigen Rassen geführt haben, sondern dass die selektive Züchtung von in der Spezies Hund bereits vorhandenen Varianten zur einheitlichen Rasse führte. Die sehr verschiedenen Hunderassen spiegeln die natürliche Variation in der Ausgangspopulation der Hunde wieder. Eine vergleichbare Situation stellen beim Menschen die schon oft untersuchten peripheren Isolate z.B. in Island oder Finnland dar. Sie sind aber immer noch sehr heterogen und viel weniger informativ als Hunderassen. Für den zweiten Schritt im Rahmen der Genkartierung be-nötigt man jetzt einen neuen Chip, auf dem die im ersten Schritt erkannte Genregion jetzt mit vielen nahe beieinander liegenden SNP-Markern repräsentiert ist.




Abbildung 3: Schematische Darstellung des Kopplungsungleichgewichts beim Menschen (oben), allgemein der Hund (Mitte) und innerhalb einer Hunderasse (unten). Der waagerecht durchgezogene Stab stellt ein DNA-Molekül dar. Die Farbmarkierung gibt ein Bruchstück mit konservierter SNP-Anordnung (Kopplungsungleichgewicht) wieder. Dieses ist bei den Hunden allgemein kleiner als beim Menschen, da mehr Generationen vergangen sind und der Wolf als Ausgangs-spezies genetisch heterogener ist als die menschliche Population es vor 200 000 Jahren war. Die Mitglieder einer Hun-derasse sind noch sehr wenig durch Cross-over Ereignisse durchmischt. Sie haben für große Bruchstücke die identische SNP-Anordnung und es reicht für etwa 1,0 Millionen Basenpaare einen einzigen SNP zu testen (unten).

Wenn man verschiedene Hunderassen in diesem zweiten Schritt untersucht, geht man an den Ursprung der Hunde vor 15.000 Jahren zurück und entsprechend groß ist auch die Anzahl der seit-dem zurückgelegten Generationen. Das heißt, die Bruchstücke mit Kopplungsungleichgewicht wer-den sehr klein, sie sind tatsächlich noch kleiner als beim Menschen (~10.000 Basenpaare, Abb. 3). Man erhält auf alle Fälle eine Zuordnung zu einem Gen, oder zu einer sehr überschaubaren DNA-Sequenz, die man sequenzieren und zwi-schen Hunden mit unterschiedlichem Merkmal vergleichen kann. Dieses zweistufige Vorgehen einer genomweiten-Assoziationsanalyse hat sich sehr bewährt. In der Tabelle 1 werden beispiel-haft die u.a. mit dieser Methode identifizierten Gene bzw. Loci für bestimmte Erkrankungen beim Hund gezeigt. Im zweiten Teil der Tabelle werden Tumorerkrankungen aufgelistet, für die ebenfalls eine rassenspezifische Prädisposition bestehen. Allgemein zeigen diese rassespezifischen Risiken, welchen großen Anteil die Familie und damit die Genetik zur Ätiologie von Erkrankungen beiträgt. Das gilt auch für den Menschen.

Kartierung eröffnet neue Perspektiven

Man hat inzwischen beim Hund auch Erfahrung mit der Kartierung von komplexen Merkmalen. Es wurde z.B. auch – wie vorher für den Men-schen beschrieben – die Körpergröße untersucht. In einem ersten Schritt wurden 463 unterschiedlich große Hunde einer Rasse und in dem zwei-ten Schritt, nachdem die Region im ersten Schritt festgelegt war, nur noch 17 Hunde aus unter-schiedlichen Rassen untersucht. Mit IGF1, Insulin like Growth Factor 1, hat man einen Genlocusbestimmt, der 15% der genetischen Variation der Körpergröße beim Hund erklärt. Der entsprechende Aufwand beim Menschen wurde bereits genannt. Man sollte hier hinzufügen, dass für die Kartierung von komplexen Erkrankungen nicht alleine die genomischen Voraussetzungen beim Hund sehr viel günstiger sind als beim Menschen, sondern auch die Komplexität eines Merkmals oder einer Erkrankung in geschlossenen Populationen bzw. Isolaten sehr viel geringer ist und dadurch die beteiligten Gene sehr viel besser mit diesen Methoden zu erkennen sind. Es soll nicht verschwiegen werden, dass der große Vorteil von GWA-Studien die vollkommene Unvoreingenom-menheit ist, mit der man mit dieser Methode an das Verstehen von Erkrankungen herangeht. Es werden von vornherein alle Gene überprüft. Das kann zur überraschenden Aufdeckung von neuen Mechanismen zur Krankheitsentstehung führen, an die bisher noch niemand gedacht hat. Z.B. handelt es sich bei den haarlosen Hunden um eine ektodermale Dysplasie mit gleichzeitigen Zahnanomalien (Abb. 4). Diese Erkrankung beim Hund weist viele Parallelen mit der anhidrotischen ektodermalen Dysplasie beim Menschen auf, für die Mutationen in Genen des Ektodysplasin-Signalwegs bekannt sind. Eine GWA-Studie beim Hund macht jetzt auch den Transkriptionsfaktor FOXI3 für diesen Phänotyp verantwortlich, was in eine völlig neue Richtung weist (Arbeitsgruppe Tosso Leeb, Bern). Vorher erwähnt wurden die 180 Loci, die zur Körpergröße beitragen. Auch darunter befinden sich Strukturproteine, Enzyme und Signalwege im Stoffwechsel, die zuvor noch nie in Betracht gezogen wurden.



Abbildung 4(a): Ein Beispiel für die haarlosen Hunde (a) zusammen
mit einem Hund mit normalem Fell (b).




Abbildung 4(b): Ein Beispiel für die haarlosen Hunde (a zusammen
mit einem Hund mit normalem Fell (b).




Abbildung 4(c): In (c ) werden die Zahnanomalien bei den haarlosen
Hunden gezeigt. Diese ektodermale Dysplasie beim Hund weist viele
Parallelen mit der anhidrotischen ektodermalen Dysplasie beim
Menschen auf.

Neue Therapiemöglichkeiten

Auch für therapeutische Ansätze bietet der Hund wegen seiner dem Menschen sehr viel ähnlicheren Physiologie (Größe, Lebensalter, gleiche Umwelt) Vorteile. Zum Beispiel leidet die Maus mit einer Mutation im Gen für die Muskeldystrophie-Duchenne in keiner Weise an dieser Erkrankung. Entweder sie lebt nicht lange genug (ungefähr 2 Jahre) oder die sehr viel kürzeren Muskelzellen können den im Muskelsarkolemm vorhandenen Defekt besser ausgleichen. Beim Hund hat man entsprechende Gendefekte beim Golden Retriever entdeckt. Die jungen männlichen Hunde sind im Alter von 4 bis 6 Monaten sichtlich betroffen und sterben mit etwa einem Jahr. Eine überraschende Variante von Gentherapie wurde an diesem Modell erprobt.Man nutzt dafür eine Kultur von Mesangioblasten, die aus einer Muskelbiopsie in Massen in-vitro auswachsen. Mesangioblasten sind mesodermale Vorläuferzellen. Diese Mesangioblasten werden in-vitro mit einem modifizierten Dystrophin-Gen transfiziert und diese gentherapierten Zellen dem Hund in sein Blutgefäßsystem injiziert. Diese me-sodormalen Vorläuferzellen wandern selbständig aus dem Kapillarsystem aus und finden damit von ganz allein den Weg in den Muskel, in den sie ein-wandern, um dann in dieser Umgebung zu Muskelzellen zu differenzieren.
Tatsächlich wird aus dem schon sichtlich kranken, jungen Hund für eine gewisse Zeit wieder ein lebensfreudiger Kamerad. Sehr viel weiter ist man bei der Therapie zum Beispiel der Leber‘schen kongenitalen Amaurosis, einer frühkindlichen Erblindung. Eine Form betrifft den Vitamin A Stoff-wechsel (RPE65) und kommt in genetisch identischer Form beim Hund vor. Mit einer subretinalen Injektion eines rekombinanten Wildtyp–RPE65-Gens kann man eine Sehverbesserung erreichen, die bis zu drei Jahren (bisher) anhält. Insbeson-dere kann man beim Hund auch belegen, dass nicht nur rein physikalisch eine Sehverbesserung erreicht wird, denn auch das Verhalten des Hunds normalisiert sich. Gerade dieser letztere Aspekt macht das Modell des Hundes besonders attraktiv. Typische Erkrankungen des älteren Menschen, wie Verhaltensstörungen, Demenzerkrankungen aber auch Tumorerkrankungen, die beim Men-schen allein vom zeitlichen Ablauf nur schwer zu untersuchen sind, laufen beim Hund etwa 5mal schneller ab und können deshalb in der Zeitspan-ne einer Forscherkarriere bearbeitet werden.

Einblick in die Genetik von Verhalten

Einen kleinen Einblick in die wirklich sehr komplexe Genetik von Verhalten haben wir bei einem nahen Verwandten des Hundes, nämlich dem Fuchs, genauer dem sibirischen Silberfuchs, erhalten. Wegen seines schönen Fells wird dieser Fuchs gezüchtet, macht aber durch seine Aggression (Bissigkeit) große Probleme. Daraufhin hat man etwa 30 Generationen auf zahmes Verhalten gezüchtet und einen Fuchs erhalten, mit dem man auf dem Arm schmusen kann, nur hat dieser Fuchs nicht mehr das schöne Fell und zur großen Überraschung hat sich auch die Kopfform geändert. Man lernt daraus, dass die für das Verhalten verantwortlichen Gene darüber hinaus noch viele andere vitale Funktionen während der Frühentwicklung und während des Stoffwechsels erfüllen.

Schlussbemerkung
Abschließen möchte ich mit einer Bemerkung für die Tierfreunde. Man braucht für diese genetischen Untersuchungen nur einmalig eine wenige Milliliter enthaltende Blutprobe von den einzelnen Hunden, was die Hunde nicht belastet. Langfristig profitieren von diesen vergleichenden Unter-suchungen die Gesundheit der Tiere und die des Menschen.
Ich danke Herrn Prof. Dr. Tosso Leeb, Institut für Genetik, Universität Bern, für viele Anregungen und die Durchsicht des Manuskripts.